柳青  林裕龙

人类感染CMV非常普遍，据WHO一项在发展中国家的调查表明，CMV抗体阳性率几乎达到90%。在正常人，CMV感染多数是隐性感染，但对一些接受器官移植的患者及孕妇却能造成较大的危害，前者主要表现的症状有单核细胞增大症、肝炎或肺炎；而后者则传染胎儿，尤其怀孕早期感染的孕妇对胎儿造成的危害更大。其中较为常见的可影响胎儿的视觉和听觉，严重者可造成胎儿先天性畸形。1988年，Demmler^（1）首次报道了PCR检测CMV以来，PCR技术已成为CMV检查的主要手段。以下检测了49例孕妇血清CMV-IgG、 CMV-IgM及PBMC和尿中CMV-DNA，报道如下。

 材料与方法

1.标本来源：收集本院门诊49例孕5-38周的进行产前检查的孕妇的外周血及尿标本。

2.CMV-IgG检测试剂：采用美国Genbio公司生产的Immuno DOT TORCH孕前检测试剂盒。

3.CMV-IgM检测试剂：购自意大利DIESSE公司

4.PCR检测试剂：引物设计参照文献，选自CMV DNA直接早期基因内的保守序列。

外引物序列为P1：5′-TGCAACGAGAACCCCGAGAA-3′，P2: 5′-ATCAATGTGCGTGAGCACCT-3′，内引物序列为P3: 5′-CTGAGGATAAGCGGGAGATG-3′，P4: 5′-CACTG AGGC AAGTTC TGCA G-3′，由上海生工生物工程公司合成。最终所得套式PCR产物为244bp。Tag DNA聚合酶及dNTP购自军事医学科学院。

5.CMV-IgG和CMV-IgM检测：严格按说明操作。

6.提取PBMC中的CMV DNA：肝素抗凝血250ul，加蒸馏水2ml使红细胞溶解，加5ml 10%的HCHO，3000rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入250ul HCHO和1ml 95%的乙醇，充分振荡后3000rpm离心5min，抽干沉淀，20ul 灭菌蒸馏水溶解备用。

7.提取尿中CMV DNA：采用PEG沉淀法，取尿3ml加固体NaCl 12mg，加PEG6000 250mg，充分混匀，冰浴30min，4000rpm离心15min，弃上清，沉淀加H₂O及0.1%SDS各200ul，置60℃ 30min，加入0.1mg/ml蛋白酶K 50ul在60℃消化30min。用酚/氯仿抽，所得DNA沉淀用20ul灭菌蒸馏水溶解备用。

8.套式PCR检测CMV DNA：以30ul反应体积行外引物的第一轮扩增，把第一轮PCR产物20倍稀释后取5ul作模板进行第二轮扩增，反应条件为93℃预变性120S，93℃变性50S，55℃退火50S，72℃延伸60S，30个循环后72℃延伸300S。两轮反应均设阴性对照，产物于2%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察，出现224bp带者为阳性，结果如图1所示。

 结  果

49例产前检查标本中，CMV-IgG阳性者33例，阳性率为67.3%，CMV-IgM阳性2例，均为CMV-IgG阳性；以尿标本进行PCR检测，发现有3例阳性，其中1例为CMV-IgG和CMV-IgM均阴性，2例为CMV-IgG和CMV-IgM均阳性；而以PBMC进行PCR检测，有4例阳性，其中1例为CMV-IgG和CMV-IgM阴性，2例为CMV-IgG和CMV-IgGM均阳性，1例为单纯CMV-IgG阳性。详细数据参见附表。

附表  49例受检者CMV-IgG、CMV-IgM和CMV DNA检测结果比较

 讨  论

人类感染CMV极为普遍，多数为隐性感染。感染CMV的特征是血液中白细胞尤其是单核细胞增大，并出现核内包涵体。据有关资料表明^（3），妊娠妇女中，2%~12%尿中可排出CMV，但很少出现临床症状，然而却有40%~50%感染CMV的孕妇可通过垂直传播途径感染胎儿，宫内CMV感染不但可以引起胎儿宫内发育迟缓、迟发性智力低下、视力损害及神经性耳聋等后遗症，而且可以引起胎儿畸形、早产、流产以及死胎。因此，产前尽早检测CMV已成为保证优生优育的一项重要手段。

    本文检测了49例孕妇CMV-IgG和CMV-IgM，其中CMV-IgG阳性率为67.3%，而CMV-IgM阳性率为4.1%。说明大多数孕妇都有CMV既往感染史，通常情况下，人体感染CMV产生CMV-IgG并达到可检测滴度需要12-17周，而机体感染CMV以后3-5天即可出现CMV-IgM抗体，CMV-IgM抗体在血液仅存在12-16周^（4），因此CMV-IgM阳性是诊断近期感染的可靠指标。由于CMV-IgM在人体血清中持续的时间较短，同时复发感染产生的CMV-IgM少，因此，CMV-IgM阴性并不能排除孕妇巨细胞病毒感染。PCR检测病毒DNA，能比较真实地反映病毒在体内的存在情况，套式PCR可检测5-10fg CMV DNA，灵敏度比常规PCR高出10-20倍，因此采用套式PCR方法，可以减少常规PCR检测中的假阴性。本文检测的结果中，CMV-IgG阳性和阴性的孕妇，其血和尿标本的PCR检测均有阳性者，说明以往感染过CMV并不能保证机体已有免疫力，仍有再次感染的可能。另外，4例PBMC标本PCR结果阳性的孕妇其尿标本有一例为阴性，究其原因，可能是尿中存在Tag酶抑制因子未能完全排除所致，或者是有些孕妇其CMV病毒由尿中排出呈现间歇性所致。

综上所述，我们认为PCR方法是产前检查CMV较为理想的方法，同时，为避免尿标本因某些因素干扰造成的假阴性，还是提倡用PBMC为佳，或者采用2次以上尿标本进行套式PCR检测。另一方面，结合CMV DNA和CMV- IgG及CMV-IgM检测，可以判断孕妇为初次感染或是再次感染CMV，较好地为临床提供参考依据。