山东省立医院  刘春

    巨分子酶的分子量较大，在体内不易排出，也不易被巨噬细胞系统吞噬而降解，又因有较长的半衰期，故在血中存留时间较长。在常规生化检验中往往易引起酶活性假性增高及同功酶的改变。它的存在干扰了酶测定的准确性，极易造成酶测定结果的错误判断和临床误诊。所以，巨分子酶的研究着实是临床诊断酶学的重要课题。

—：巨分子酶的分子结构
1. 酶与免疫球蛋白的复合物。例：CK-BB-IgG CK-MM-IgA等。通常巨分子酶的免疫球蛋白是IgG和IgA.，偶见IgM。
2. 酶与其它蛋白质的复合物。如：LDH-β 脂蛋白。
3. 酶亚基或酶分子间的聚合物。例：CK-Mt聚合物，LDH-亚基自身复合物。

二：巨分子酶的种类
    CK、LDH、AMY、GGT、ALP
三：巨分子酶的实验室鉴定（以巨CK为例）
标本的特点：免疫抑制法测定CK-MB作为诊断急性心肌梗塞或心肌损伤的特异性指标已在临床广为应用。免疫抑制法测定CK-MB方法的原理是用抗体将M亚基抑制，测定B亚基活性，结果乘以2既为CK-MB活性。当血清中出现巨CK或CK-BB时，由于巨CK和CK-BB不被M亚基抗体抑制，其活性百分之百被测出，且还要乘2，因此就出现了CK-MB等于或高于总CK的现象。事实上，CK-MB活性占总CK活性的比例很少出现30%以上。一旦有这样的结果出现，就要怀疑巨CK的存在，需要进一步鉴定。
鉴定方法
1：琼脂糖凝胶电泳 
    肌酸肌酶同功酶含两种亚基，M亚基和B亚基。肌酸肌酶由这两种亚基组成的二聚体。三种不同的组成方式合成三种同功酶。MM型主要来自心肌和骨骼肌，MB型主要来自心肌，BB型主要来自中枢组织。每一种同功酶分子所带电荷不同，在特定电泳条件下，电场中泳动率各不相同。    
    将患者血清10ul加样于琼制糖凝胶板阴极测2cm处，150V电泳20min，电泳毕在凝胶板上覆盖CK底物并盖一塑料薄膜。凝胶板置于37℃温育30min，温育后除去覆盖的塑料薄膜烘干进行扫描。电泳时必须同时做质控（内含CK-MM CK-MB CKBB）以资对照。
琼脂糖凝胶电泳CK同功酶质控血清可显示三条区带，CK-BB位于阳极侧白蛋白区域，CK-MB位于中间a2或β球蛋白区域，CK-MM位于阴极侧r球蛋白区域。而巨CK1迁移于CK-MM与CK-MB之间。巨CK2时位于CK-MM的阴极侧。
2：巨CK的活化能测定
测定活化能的原理为酶的活性依赖于温度。
其公式为：I n Kcat= -Ea/RT+InA =InU/L
其中Kcat为酶催化反应速度常数，Ea为活化能（KJ/mol）,R为气体常数（8.3X10-3KJ/mol℃）。T为绝对温度（K）,A为碰撞因数，试验条件下Kcat以U/L替代，碰撞因数假定为常数393和313K,当In（U/L）对 I/T作图。曲线线性部分的斜率b可以用回归方程计算出来，因此活化能计算可以用下面公式：-Ea/RT=b/T,-Ea=-8.3X10-3Xb（KJ/mol）
分析程序:为避免CK-MM的干扰，病人标本用免疫抑制法分别于25℃，30℃，37℃，测定非CK-M活性。正常对照按CK总活性分别测定以上三种温度的CK活性。正常CK和巨CK1的酶活化能范围为 45-65KJ/mol.巨CK2的酶活化能为80-140KJ/mol.
3：热失活试验
将血清置45℃20min,测定CK残余活性，CM-BB和CK-BB几乎完全失活，而巨CK不受影响。
4：CK-MB质量
用单克隆抗体直接检测CK-MB质量或用双位点单克隆抗体酶标法测定CK-MB真正含量。非CK-MB为阴性。
5：免疫学方法和电泳结合进行测定
生理盐水，效价为1：6的羊抗人IgG和IgA各100ul分别放于三只试管内，各加入患者血清25ul置于4℃过夜，2000r/min离心15min,取上清液10ul进行CK同功酶电泳,观察与Ig温育前后电泳带的变化。结果显示与盐水温育应无改变。巨CK2无论与盐水或各种Ig抗体温育也无任何改变，巨CK1则不同，当其与抗体IgG或IgA温育后原有的异常带减弱或完全消失或出现新的条带，只要与相应的抗Ig温育后发生改变既提示巨CK1涉及该种免疫球蛋白（IgG  IgA）。

6：CK-BB
    CK-BB存在于健康人脑组织、胃肠道和子宫平滑肌内。正常人血清中无CK-BB。当上述组织坏死时可出现血清CK-BB增高。会干扰免疫抑制法CK-MB测定。
血清中巨CK1.巨CK2和游离CK-BB的鉴别标准   见表

    巨CK1是一种CK同功酶与自身抗体的复合物，最多的是CK-BB与IgG和IgA的复合物。文献报道巨CK1发病率为4%-13.8%,妇女、老年人多见。有报道在肌炎患者特别是.低血K性肌炎的妇女血清中易出现巨CK.。许多文献认为巨CK1与自身免疫性疾病无明显联系。发现巨CK1的患者血清中免疫球蛋白及其组分并无明显的改变。甚至在健康人血中检出。由于巨CK1常表现为CK-MB假性增高，对临床症状不明显及原先有心肌缺血者易引起错误的判断，故临床在解释结果时应加以警惕。
巨CK2时一种低聚的线粒体CK,又称CK-Mt,存在于细胞线粒体膜上，当线粒体崩解时，线粒体的小碎片进入血液，故CK-Mt成低聚状态。巨CK2比其他同功酶分子量大，比巨CK1或游离CK同功酶有着较高的活化能，往往在恶性疾患病人血中出现。众多文献认为巨CK2不会在健康人血中出现，它与恶性肿瘤密切相关，可作为肿瘤标志物。Lee检测42例肺癌患者血清，原发性肺癌巨CK2的检出率为56.8%，肺癌组CEA测定的阳性率40%.在肺癌组中患上皮癌和肺癌第3第4期患者巨CK2的检出率分别为71.3%和65.4%，Koven认为巨CK2也可为胃肠道恶性肿瘤的标志物，他们检查了13例结肠癌患者，手术前有9例血清中出现巨CK2；21例结肠癌和胃癌转移的患者其中有16例检出巨CK2。长征医院鉴定了30例血清内有巨CK2标本。其中经病理证实为恶性肿瘤患者14人（肝细胞癌8例.乳腺癌2例.脑膜转移癌1例，宫颈鳞癌1例，结肠癌2例且都有肝骨转移）另有五例肝硬化者；还从130例年龄在6-15岁的心肌炎患者血清中检出10例含巨CK2.，所检测出的30例血内含有巨CK2的患者无一例是健康人，且巨CK的活性都占总CK活性30%以上，有的几乎等于总CK活性。
    巨CK的测定方法最常用的方法时琼制糖凝胶电泳，简单，快速，可直接定位。如电泳定位确定是巨CK1，还必须做免疫分析。随着免疫抑制法和电泳法测定CK-MB的普及，巨CK的发现会不断增加。因此巨CK鉴定方法的建立。可以避免因免疫抑制法测定CK-MB时所造成的假阳性的发生，CK-MB通常约占总CK的30%以下，如果CK-MB值远大于总CK的40%以上，甚至出现CK-MB等于大于总CK，标本无溶血，一定要警惕有无巨CK或CK-BB的存在。只有保持高度的警惕，才不会造成错误诊断。