5．SRM 2B的组成与表现

每个SRM 2B的安瓿内含有混合人血清、稳定剂与防腐剂叠氮钠（1.08 g/L）的冻干物。复溶的SRM 2B内含有以下的各个脂类在低或正常的水平：胆固醇（3.6 mmol/L），甘油三酯（0.6 mmol/L），LDL-胆固醇（2.3 mmol/L），HDL-胆固醇（1.0 mmol/L）；蛋白为37 g/L。样品经1：100稀释后，浊度＜1％光散射单位、或于340 nm处的吸光度为0.0132，可以忽略不计。Lp(a)的异构体由三个主要的apo(a)多形体组成，在凝胶上表现几乎相等的强度，各含有16、17与18个K4环饼结构。三个最少的多形体分别为14、20与32个K4环饼结构。

    经观察，SRM 2B的Lp(a)含量与电泳表现，6年没有变化。在这段时间内，使用SDS-琼脂糖电泳与免疫印迹检验，没有发现apo(a)增加的区带或凝集产品。复溶后，若紧盖并保存于2～8℃，可稳定1周。复溶液不能冰冻，若出现沉淀应弃去。

三．Lp(a)标准化工作的第三阶段：使用推荐的SRM 2B参考物质后对实现患者血清检测结果一致性的评估

22个检测系统以SRM 2B校准后，检测三个控制品，Lp(a)的浓度在29、104与185 nmol/L，方法间的CV分别为：11.9％、11.5％与9.5％。然后各个检测系统使用校准值可溯源至SRM 2B的自制校准品，校准系统后再检测这三个控制品，结果与上述几乎一样。另外，在排除一个有问题的系统后，方法间检测SRM 2B的CV仅2.8％；除了一个系统外，其余系统结果的均值与靶值差异在5 nmol/L内。

以这些结果为基础，在第三阶段由16个厂商与6个研究实验室对SRM 2B材料评估，确定它是否具有将基础的准确值传递给厂商的校准品的能力；并经该物质标准化后，在各个方法间结果的一致性的能力。选择了30份健康供体的新鲜冰冻血清，内含Lp(a)值与apo(a)异构体范围大而广；具有的K4 apo(a)区域为13～31个、Lp(a)含量范围为10～414 nmol/L，使用a-40 ELISA Lp(a)参考方法为之定值。各个Lp(a)检测系统包括：10个免疫透射比浊测定（ITA）、8个免疫散射比浊测定（INA）、2个荧光免疫测定（FIA）、1个免疫电泳测定和1个ELISA。几乎所有的检测系统均使用多克隆抗体抗检测Lp(a)的apo(a)部分，来检测Lp(a)，有2个ITA方法使用标记于胶乳颗粒的单克隆抗体，1个FIA方法（DELFIA a/B）使用了抗apoB作为检测抗体的多克隆抗体。

30例样品的检测结果CV从6％～31％。样品浓度在Lp(a)＜25 nmol/L的，CV为19％～31％；Lp（a）在100～414 nmol/L的，CV为6％～17％。每个Lp(a)检测系统的检测值与协同的参考检测系统的定值作比较，评价各系统的准确度。结果说明在30份样品中apo（a）异构体范围大，各检测系统对apo(a)大小的非均一很敏感，对于apo(a)异构体分布广泛的各个样品，检测结果变异明显大于SRM 2B。Lp(a)的胶乳增强ITA方法是最准确的检测系统，它们的平均绝对偏倚仅4.4 nmol/L；其它方法的偏倚为12.4～23.8 nmol/L。仅两个Lp(a)检测系统对apo(a)异构体的非均一具有最小的偏倚。通过使用SRM 2B，在Lp（a）的胶乳增强ITA方法与Lp(a)的协同参考a1-40 ELISA测定间，具有了极其重叠的Lp(a)结果。很明显，无论是一级或二级的参考物质，因为apo(a)大小的非均一的影响，都不能消除不同分析方法间得到的Lp(a)值的实质性差异。

四．WHO生物标准专家委员会批准IFCC SRM 2B为“第一个Lp(a)免疫测定国际参考试剂”

WHO生物标准专家委员会在批准IFCC SRM 2B为“第一个Lp(a)免疫测定国际参考试剂”中，不仅要求标准化计划的实验设计与实施具有科学性，而且也要求文件完整，报批过程严密；为此，所有工作又延长了3年才完成。这些包括：技术报告的编写、对IFCC SRM 2B长期储存与监视的数据收集、将参考物质与确认材料分送评估等。初步批准该物质为可行的参考物质的是IFCC科研部门成员，然后是IFCC的执行董事会，是他们于2002年早期将IFCC SRM 2B上交给WHO，要求认可为Lp(a)国际参考试剂。技术报告送给WHO生物标准专家委员会（WHO ECBS），希望在2003年2月的年会前作评论。经初步评估，WHO还要求进一步明确系列技术要点，特别是物质在高温下、复溶后的稳定性，批间的恒定性，以及分送评估的文件。并要求最终表示为每个安瓿的含量，而不是Lp（a）浓度，还需要Lp(a)定值的不确定度。确保实施ISO导则，实现可追溯性与检测的不确定度。

最后，WHO在2003年11月，正式接受IFCC SRM 2B为“第一个Lp(a)免疫测定国际参考试剂”，完整的称呼为：WHO/IFCC SRM 2B。该参考物质储存于玻璃安瓿，内含0.1071±0.0086 nmol的Lp(a)（依据分装时的不精密度，变异为2.9％）。它的定值可追溯至Lp(a)的协同参考检测系统。依据欧共体的体外诊断医学产品通则（IVDD），要求诊断公司的校准品值在计量上可追溯至较高水平的参考物质。使用WHO/IFCC SRM 2B将符合IVDD的要求。IFCC SRM 2B保存在美国西雅图的西北脂类研究实验室，供Lp（a）研究部门与诊断厂商使用。

总之，IFCC的Lp(a)测定标准化工作组的初衷，已经为统一免疫测定Lp(a)结果提供了实在的解决方法。所以，通过IFCC的努力，校准Lp(a)检测系统的全球性协同已经实现。WHO/IFCC SRM 2B的使用将消除检测系统间变异的主要因素。通过使用标准化方法可溯源至“第一个WHO/IFCCLp(a)免疫测定国际参考试剂”，如推荐那样，现在可以作出确定在各种人群中未来心血管疾病危险增加的判断限。

五．将Lp(a)定值转移给靶物质的程序

在提供SRM 2B的同时，还有3个冰冻血清，以确认值转移的成功。

  1．使用复溶的SRM 2B（Lp(a)值107.1 nmol/L），依据您日常的检测方案校准您的Lp(a)测定。应将SRM 2B配制于磷酸盐缓冲液，作预先稀释。

  2．在2天内，进行两批实验；每批对3个您的一级校准品分别进行4次检测。一共得到48个Lp(a)值。

  3．每批应进行校准曲线的绘制。

  4．确定您一级校准品的Lp(a)均值与标准差。

  5．使用一级校准品得到的Lp(a)均值，按照您日常Lp(a)测定程序进行校准。

  6．冻融3个水平的冰冻血清样品各一支（A0x、B0x、C0x），内含不同大小的apo(a)，在您的Lp(a)测定程序中检测，以确定值转移程序的准确度。