二．选择参与Lp(a)标准化工作的检测系统

1．确认一致同意的Lp(a)参考方法

为了准确检测所有血浆样品中的Lp(a)，与apo(a)颗粒多态性无关，在美国西雅图的华盛顿大学西北脂类研究实验室，使用抗apo(a)的K4 type9的表面决定簇的单克隆抗体，形成了直接结合的双单克隆抗体酶联免疫测定方法（a-40 ELISA），检测血浆中的Lp(a)。许多研究工作者对该检测方法作了详细的评价，说明apo(a)的不均一不影响测定准确度。使用抗apo(a)K4 type8决定簇的不同检测抗体，又形成了另一个免疫测定（a1-1 ELISA），也显示了它对apo(a)异构体大小不均一的不敏感。因为以上任何单克隆抗体都不会与apo(a)分子的多变部分的决定簇反应，可以摩尔（mol）单位表示设定靶值。

2．选择合适的Lp(a)参考物质

在标准化的第一阶段，对8个Lp(a)商品校准品检测了分析性能，其中一些校准品显示了在精密度、线性与平行性的测定特性上，与血清样品具有可比性。对Lp(a)值单位处理后，一些校准品的Lp(a)值在方法间很靠拢，但其它的离散很大。因此，IFCC工作组不采用现有的任何公司校准品为候选的参考物质。

在第二阶段，对4个新制备的材料检测了精密度、线性、互通性以及方法一致性等，使用了27个检测系统予以检测（表1）。

    表1 选择合适的Lp(a)参考物质：四个候选的Lp（a）参考物质（PRM）在27个最优化的检测系统中的分析性能^（注1）。

注：IHSP（in-house serum pool，自制混合血清）；FSCC（frozen serum control C，冰冻血清控制品C）。

注1：是对于IHSP最优化的检测系统（即在对人血清检测属最佳的系统）；

注2：精密度为检测系统内CV的中位数。这是对50%与100％的PRM进行Lp(a)重复检测的结果；

注3：线性评估：对PRM从20％～100％，互相间隔10％的Lp(a)线性实验；判断：线性回归的斜率为0.9～1.1，截距在－10％～＋10％间，为线性。

注4：平行性：对9个同一个稀释度的PRM、FSCC与IHSP进行Lp(a)检测，用单向的ANOVA比较它们的回归斜率；若可能性p＞0.01，认为具有平行性。

注5：评估检测系统的协同性：对系统间校准差异作Lp(a)浓度纠正后，系统间检测结果差异的CV％。（依据FSC C为标准）。

经比较，SRM 2B使18个INA与ITA检测系统的变异小于8％（表2），显示分析性能可接受；以及在稳定性上表现良好。所以选择SRM 2B为Lp(a)的通用校准品，用于进行一致性检测调查前，为各个系统的厂商校准品定值。

    表2  27个检测系统对二级参考物质SRM 2B进行Lp(a)检测结果的均值与标准差（按照方法分类）。

注：CHOL方法为Lp(a)-胆固醇-测定；DELFIA方法为dissociation－enhanced－ligand 荧光免疫测定；INA为免疫散射比浊测定；ITA为免疫透射比浊测定。在检测SRM 2B的Lp(a)浓度时，均以FSC C为标准，校准后检测SRM 2B的100％与50％的质量浓度。然后将正确的质量浓度值转换为nmol，以a-40 ELISA的Lp(a)结果为准予以换算。

3．确定Lp(a)的一级参考物质

对来自含有19个K4区域的单一apo(a)异构体的供体血清，在两个独立实验室分别进行Lp(a)的分离与纯化。一个实验室使用连续超离心与分子网层析等技术分离；另一个实验室采用赖氨酸-葡聚糖凝胶过滤和氯化铯分级超离心技术分离纯化Lp(a)。二者Lp(a)的化学组成非常相似；每个分离制品作氨基酸重复分析，确定Lp(a)蛋白作摩尔单位的准确绝对质量。成为Lp(a)一级参考物质。

4．对SRM 2B的Lp(a)定值

使用两个实验室制备的Lp(a)一级参考物质，为SRM 2B设定靶值。使用对每个新鲜制备的分离Lp(a) 。使用一致统一的两个ELISA参考方法（使用的单克隆抗体分别为a-40或a1-1）进行定值。两个参考物质、两个参考方法组合的四个检测系统，每一个系统均绘制6点的标准曲线，每点重复4次。共进行4天实验，每天在各个组合系统的3个板上，各对SRM 2B进行一组双份测定。同时，在每个板上分析4个控制品，每个控制品进行双份检测。在4个连续天内，共得到SRM 2B的144个结果。所有定值结果可参见表3。无论使用哪一个Lp(a)一级参考制品、或无论使用哪一个ELISA参考方法，对SRM 2B的定值非常相似，最后的定值为：107.1nmol/L±8.6 nmol/L。

表3  IFCC参考物质，SRM 2B的Lp(a)浓度，使用两个Lp(a)制品为标准、用两个ELISA方法检测